Детекція мікроРНК (мікроРНК) є важливим етапом у молекулярних біологічних дослідженнях, оскільки ці молекули відіграють ключову роль у регуляції генів, пов’язаних з розвитком, хворобами, імунними відповідями та багатьма іншими процесами.
МікроРНК часто регулюють експресію генів на посттранскрипційному рівні через взаємодію з мРНК. Існує кілька методів для детекції мікроРНК, які дозволяють дослідникам виявляти, кількісно оцінювати і аналізувати ці молекули.
1. ППР (Полімеразна ланцюгова реакція) з зворотним транскрипцією (RT-PCR)
Цей метод є одним із найбільш поширених для детекції мікроРНК. Він базується на використанні зворотної транскриптази для перетворення мікроРНК у комплементарну ДНК (кДНК), після чого проводиться полімеразна ланцюгова реакція (PCR) для ампліфікації і виявлення певних мікроРНК.
- RT-qPCR (кількісна ППР) дозволяє точно визначити рівень експресії мікроРНК у різних зразках, використовуючи флуоресцентні мітки для визначення кількості продукту.
- RT-PCR з використанням специфічних праймерів для певних мікроРНК дозволяє детектувати конкретні молекули.
2. Мікрочіпи для РНК (мРНК і мікроРНК)
Цей метод дозволяє одночасно виявляти і кількісно оцінювати тисячі різних мікроРНК у одному зразку. Він базується на гібридизації мікроРНК з комплементарними олігонуклеотидами, закріпленими на поверхні чіпа.
- Мікрочіпи на основі нуклеотидних послідовностей: кожен з олігонуклеотидів на чіпі відповідає певній мікроРНК.
- Мікрочіпи з флуоресцентними маркерами: вони дозволяють одночасно визначити рівень експресії великої кількості мікроРНК.
3. Гелевий аналіз гібридизації (Northern Blot)
Цей метод застосовується для виявлення і розмірного аналізу мікроРНК. В основі методу лежить гібридизація мікроРНК з радіоактивно або флуоресцентно міченими зондами, що є комплементарними до певних мікроРНК.
- Northern Blot дає можливість оцінити як наявність мікроРНК, так і її молекулярну масу.
- Цей метод є менш чутливим і менш специфічним, ніж RT-PCR, але може бути корисним для вивчення профілів експресії мікроРНК у зразках.
4. Секвенування нового покоління (NGS)
Секвенування мікроРНК за допомогою технологій нового покоління дозволяє отримати великі обсяги даних про всі мікроРНК, присутні в зразку. За допомогою цього методу можна:
- Оцінити весь профіль експресії мікроРНК в клітинах чи тканинах.
- Виявляти нові мікроРНК.
- Оцінювати їх кількісні зміни між різними умовами чи зразками.
NGS є надзвичайно чутливим і дозволяє проводити детальний аналіз.
5. Рідинно-фазова гібридизація
Цей метод включає в себе виявлення мікроРНК за допомогою гібридизації з флуоресцентно міченими зондами в рідкій фазі. Він зазвичай використовується в поєднанні з PCR або іншими методами для підвищення чутливості.
6. Системи для аналізу в реальному часі
- Технології на основі наночастинок використовують мікросистеми для виявлення мікроРНК, де наночастинки з наночастками золота або срібла використовуються для гібридизації з мікроРНК і виявлення їх за допомогою оптичних або електрохімічних сигналів.
7. Методи на основі флуоресценції та люмінесценції
Використовуються зондами, які змінюють свою флуоресценцію або люмінесценцію при гібридизації з мікроРНК. Цей метод може бути використаний для високочутливого виявлення та кількісного аналізу.
8. Система РНК-мікроРНК-полімераза (LAMP)
Цей метод дозволяє детектувати мікроРНК за допомогою ампліфікації ДНК за специфічними праймерами. Хоча цей метод переважно використовують для РНК, він може бути адаптований і для виявлення мікроРНК.
Вибір методу для детекції мікроРНК залежить від поставлених задач, чутливості, доступності обладнання та необхідної точності. Для кількісної оцінки часто використовують RT-PCR або NGS, в той час як для аналізу профілів експресії мікроРНК мікрочіпи і секвенування нового покоління є дуже потужними інструментами.