Репарація ДНК — це сукупність молекулярних механізмів, за допомогою яких клітини розпізнають пошкодження або помилки в молекулі ДНК, усувають їх, відновлюють правильну структуру генетичного матеріалу або, якщо безпосереднє відновлення неможливе, забезпечують проходження реплікації повз пошкоджену ділянку. Репарація є фундаментальною умовою генетичної стабільності: ДНК постійно пошкоджується внаслідок спонтанних хімічних реакцій, метаболічних процесів, помилок реплікації, ультрафіолетового та іонізуючого випромінювання, а також дії хімічних мутагенів. Клітини мають декілька взаємопов’язаних систем репарації, кожна з яких спеціалізується на певних типах пошкоджень. До основних належать базова ексцизійна репарація, нуклеотидна ексцизійна репарація, репарація невідповідностей, пряма репарація, гомологічна рекомбінація, негомологійне з’єднання кінців і спеціалізовані механізми усунення міжланцюгових зшивок.
Біологічне значення репарації ДНК
Генетична інформація повинна залишатися достатньо стабільною протягом усього життя клітини та передаватися дочірнім клітинам із дуже високою точністю. Однак ДНК не є хімічно інертною молекулою. У ній постійно виникають модифіковані основи, розриви ланцюгів, неправильні спарювання, хімічні аддукти та інші ушкодження.
За відсутності ефективної репарації пошкодження накопичувалися б, блокували реплікацію та транскрипцію і швидко підвищували частоту мутацій. Саме тому клітини мають численні ферментні системи, які безперервно контролюють стан генетичного матеріалу.
Репарація не забезпечує абсолютної незмінності геному. Частина пошкоджень залишається невиправленою або відновлюється неточно, створюючи мутації. Саме рідкісні спадкові зміни забезпечують генетичну варіабельність, необхідну для еволюції. Отже, клітина підтримує компроміс між максимально точним збереженням генетичної інформації та можливістю її поступової зміни.
Пошкодження ДНК
Пошкодження ДНК — це хімічна, структурна або топологічна зміна молекули, яка може порушувати її нормальну функцію.
До основних типів належать:
- модифікації азотистих основ;
- депуринація;
- деамінація;
- окиснення;
- алкілування;
- утворення об’ємних хімічних аддуктів;
- циклобутанові піримідинові димери;
- 6–4-фотопродукти;
- абазичні ділянки;
- одноланцюгові розриви;
- дволанцюгові розриви;
- неправильні спарювання основ;
- вставки та делеції;
- міжланцюгові зшивки;
- зшивки ДНК із білками;
- структурні аномалії та нестабільні повтори.
Різні типи пошкоджень розпізнаються різними білками та запускають різні шляхи репарації.
Ендогенні пошкодження ДНК
Значна частина пошкоджень виникає без впливу зовнішніх мутагенів.
До ендогенних джерел належать спонтанний гідроліз, метаболічні реакції, реактивні форми кисню та азоту, побічні продукти клітинного метаболізму і помилки реплікації.
Наприклад, цитозин може спонтанно деамінуватися до урацилу, пуринові основи можуть втрачатися внаслідок депуринації, а реактивні форми кисню можуть окиснювати гуанін до 8-оксогуаніну.
Тому навіть клітина, яка не контактує з очевидними зовнішніми мутагенами, постійно потребує систем репарації.
Екзогенні пошкодження ДНК
Зовнішні фактори можуть значно збільшувати навантаження на системи репарації.
До них належать ультрафіолетове випромінювання, рентгенівське та гамма-випромінювання, деякі хімічні речовини, поліциклічні ароматичні сполуки, алкілювальні агенти та інші мутагени.
Різні агенти утворюють різні види пошкоджень, тому клітина не має єдиного універсального механізму репарації.
Пошкодження основ
Азотисті основи можуть окиснюватися, деамінуватися, алкілюватися або зазнавати інших хімічних змін.
Невеликі модифікації основ зазвичай не спричиняють значної деформації подвійної спіралі. Тому для їхнього усунення використовується переважно базова ексцизійна репарація.
Прикладом є 8-оксогуанін, який може неправильно спаровуватися з аденіном і сприяти виникненню мутацій, якщо його не видалити.
Депуринація
Депуринація — це спонтанне розщеплення зв’язку між пуриновою основою та дезоксирибозою.
У результаті в ДНК утворюється абазичний, або AP-, сайт — ділянка, у якій цукрово-фосфатний остов зберігається, але азотиста основа відсутня.
AP-сайти є нестабільними та можуть призводити до подальшого пошкодження. Вони розпізнаються ферментами базової ексцизійної репарації.
Деамінація
Деамінація — це видалення аміногрупи з азотистої основи.
Одним із найважливіших прикладів є перетворення цитозину на урацил. Урацил не є нормальною основою ДНК, тому він розпізнається спеціалізованою ДНК-глікозилазою.
Деамінація 5-метилцитозину утворює тимін. Через це метильовані CpG-ділянки є важливими мутаційними гарячими точками геному.
Окиснювальне пошкодження
Реактивні форми кисню можуть пошкоджувати як основи, так і цукрово-фосфатний остов ДНК.
Одним із найбільш досліджених продуктів окиснення є 8-оксогуанін. Якщо він не буде видалений до реплікації, може виникнути неправильне спарювання та зрештою заміна G–C на T–A.
Окиснювальні пошкодження усуваються переважно системами базової ексцизійної репарації.
Алкілування ДНК
Алкілювання полягає у приєднанні алкільних груп до атомів у складі азотистих основ.
Деякі алкільовані основи неправильно спаровуються під час реплікації, інші блокують роботу ДНК-полімераз або змінюють структуру молекули.
Для окремих алкільованих основ існують механізми прямого відновлення, а інші видаляються ексцизійними шляхами.
Ультрафіолетове пошкодження
Ультрафіолетове випромінювання може спричиняти утворення ковалентних зв’язків між сусідніми піримідинами.
Найвідомішими продуктами є циклобутанові піримідинові димери та 6–4-фотопродукти. Вони деформують подвійну спіраль і можуть блокувати реплікацію та транскрипцію.
У людини такі пошкодження переважно усуваються нуклеотидною ексцизійною репарацією. Дефекти цього механізму лежать в основі ксеродерми пігментної — спадкового захворювання з надзвичайною чутливістю до ультрафіолету та високим ризиком раку шкіри.
Іонізуюче випромінювання
Іонізуюче випромінювання може пошкоджувати ДНК безпосередньо або через утворення реактивних частинок під час радіолізу води.
Виникають окиснені основи, одноланцюгові та дволанцюгові розриви, абазичні ділянки та складні кластерні пошкодження.
Особливо небезпечними є дволанцюгові розриви, оскільки обидва ланцюги ДНК пошкоджені в одному місці.
Помилки реплікації
Під час копіювання ДНК ДНК-полімераза може вставити неправильний нуклеотид.
Висока точність реплікації забезпечується кількома рівнями контролю. ДНК-полімерази мають механізми коректури, або proofreading, за яких щойно синтезований фрагмент перевіряється, а неправильний нуклеотид видаляється за допомогою 3′→5′-екзонуклеазної активності.
Частина помилок залишається після proofreading. Саме для них функціонує система репарації невідповідностей.
Основні класи репарації ДНК
Традиційно виділяють декілька основних механізмів:
Пряма репарація — безпосереднє повернення пошкодженої структури до нормального стану.
Базова ексцизійна репарація, BER — видалення окремої пошкодженої основи.
Нуклеотидна ексцизійна репарація, NER — видалення фрагмента ланцюга навколо великого пошкодження.
Репарація невідповідностей, MMR — виправлення помилок спарювання, що залишилися після реплікації.
Гомологічна рекомбінація, HR — точне відновлення дволанцюгових розривів за допомогою гомологічної ДНК.
Негомологійне з’єднання кінців, NHEJ — безпосереднє з’єднання кінців дволанцюгового розриву.
Репарація міжланцюгових зшивок — комплексний механізм усунення ушкоджень, які фізично з’єднують два ланцюги ДНК.
Толерантність до пошкоджень і транслесійний синтез — механізми, які дозволяють реплікації продовжуватися навіть за наявності невиправленої перешкоди.
Ці шляхи можуть діяти окремо або взаємодіяти між собою.
Пряма репарація
Пряма репарація не потребує вирізання пошкодженої основи з ДНК.
Фермент безпосередньо змінює пошкоджену хімічну групу або структуру та повертає молекулу до нормального стану.
Одним із найвідоміших прикладів є фотоліаза, яка у багатьох організмів використовує енергію світла для розщеплення циклобутанових піримідинових димерів.
У плацентарних ссавців, включно з людиною, класична фотоліазна репарація ультрафіолетових димерів відсутня, тому такі ушкодження переважно усуваються NER.
Іншим прикладом прямої репарації є фермент O6-метилгуанін-ДНК-метилтрансфераза, який переносить метильну групу з O6-метилгуаніну на власний залишок цистеїну. Такий фермент фактично витрачається в процесі реакції.
Базова ексцизійна репарація
Базова ексцизійна репарація, BER, спеціалізується на невеликих пошкодженнях, які не спричиняють значної деформації подвійної спіралі.
До них належать окиснені, деаміновані та деякі алкільовані основи.
BER зазвичай проходить через такі стадії:
розпізнавання пошкодженої основи;
видалення основи ДНК-глікозилазою;
утворення AP-сайту;
розщеплення цукрово-фосфатного остова;
видалення залишкового пошкодженого цукру;
заповнення проміжку ДНК-полімеразою;
закриття останнього розриву ДНК-лігазою.
Таким чином, BER замінює дуже невелику ділянку ДНК і зазвичай мінімізує втрату генетичної інформації.
ДНК-глікозилази
ДНК-глікозилази є першою лінією BER.
Кожна глікозилаза розпізнає певний спектр пошкоджень. Для цього фермент взаємодіє з подвійною спіраллю та може «вивертати» окрему основу з її положення всередині спіралі для перевірки.
Після розпізнавання пошкоджена основа від’єднується від дезоксирибози, але фосфодіестерний остов спочатку залишається.
Існують глікозилази для урацилу, окиснених пуринів і піримідинів, алкільованих основ та інших модифікацій.
AP-ендонуклеаза
Після видалення основи залишається AP-сайт.
AP-ендонуклеаза розпізнає таку ділянку та розщеплює фосфодіестерний ланцюг поблизу неї.
Подальша обробка залежить від конкретного варіанта BER. Кінцева стадія полягає у відновленні правильної нуклеотидної послідовності та герметизації ланцюга.
Коротка та довга BER
BER може проходити за коротким або довгим механізмом.
У короткому варіанті замінюється один нуклеотид.
У довгому варіанті синтезується короткий фрагмент із декількох нуклеотидів, після чого зайвий фрагмент видаляється спеціальною нуклеазною активністю та здійснюється лігування.
Нуклеотидна ексцизійна репарація
Нуклеотидна ексцизійна репарація, NER, призначена для значно більших пошкоджень, які деформують подвійну спіраль.
До них належать фотопродукти ультрафіолетового випромінювання та великі хімічні аддукти.
На відміну від BER, NER зазвичай не розпізнає конкретну пошкоджену основу як таку. Система значною мірою реагує на структурне спотворення подвійної спіралі.
У людини ключовими компонентами NER є білки XPC, XPA, TFIIH, XPF–ERCC1 та XPG. XPB і XPD у складі TFIIH беруть участь у локальному розкручуванні ДНК, а XPF–ERCC1 та XPG здійснюють розрізи з різних боків пошкодження.
Глобальна NER
Глобальна геномна NER контролює значну частину геному та виявляє пошкодження незалежно від того, чи відбувається в цій ділянці транскрипція.
Важливу роль у первинному розпізнаванні багатьох структурних дефектів відіграє комплекс XPC.
Після розпізнавання формується великий ремонтний комплекс, який локально розкручує ДНК і вирізає пошкоджений олігонуклеотид.
Репарація, пов’язана з транскрипцією
Транскрипційно-залежна NER спеціалізується на пошкодженнях, які блокують РНК-полімеразу під час транскрипції активного гена.
Зупинка транскрипції сигналізує про наявність пошкодження. Після цього залучаються спеціалізовані білки та компоненти NER.
Таким чином клітина може надавати пріоритет відновленню генів, які активно експресуються.
Репарація невідповідностей
Mismatch repair, MMR, виправляє неправильні пари основ та невеликі петлі вставок або делецій, що виникають під час реплікації.
Система повинна розпізнати невідповідність і визначити, який ланцюг є новосинтезованим та містить помилку.
У людини ключовими білками є MSH2, MSH6, MSH3, MLH1, PMS2 та споріднені компоненти.
Після розпізнавання невідповідності дефектна ділянка видаляється, а ДНК синтезується заново за правильним матричним ланцюгом.
Значення MMR
MMR є одним із головних бар’єрів проти накопичення мутацій під час поділу клітин.
Порушення MMR призводить до так званого фенотипу мікросателітної нестабільності. У людини дефекти MMR можуть спричиняти спадкову схильність до певних видів раку, зокрема до синдрому Лінча.
Дволанцюгові розриви
Дволанцюговий розрив, DSB, виникає тоді, коли обидва ланцюги ДНК розриваються в близьких позиціях.
Такі ушкодження можуть бути спричинені іонізуючим випромінюванням, реактивними формами кисню, хімічними агентами, механічним стресом реплікації або помилками під час обробки інших пошкоджень.
DSB особливо небезпечні, оскільки неправильне з’єднання кінців може спричинити мутації, делеції, інверсії або транслокації.
Основними шляхами їхнього відновлення є NHEJ та HR.
Негомологійне з’єднання кінців
NHEJ відновлює дволанцюгові розриви без необхідності використання гомологічної копії ДНК.
У людини процес починається з розпізнавання кінців розриву комплексом Ku70–Ku80. Далі залучається DNA-PKcs та інші компоненти, які організовують обробку та з’єднання кінців.
Комплекс XRCC4–DNA ligase IV здійснює фінальне лігування.
NHEJ особливо важливе в G0 і G1-фазах клітинного циклу, коли сестринська хроматида недоступна як шаблон для гомологічної рекомбінації.
Точність NHEJ
NHEJ часто називають потенційно помилковим механізмом, оскільки кінці розриву можуть бути пошкоджені або несумісні.
Перед з’єднанням кінці можуть потребувати обробки — видалення нуклеотидів або їхнього додавання.
Тому після NHEJ іноді виникають невеликі делеції або вставки.
Водночас NHEJ може бути надзвичайно точним, якщо кінці розриву сумісні та не потребують значної обробки.
Альтернативне з’єднання кінців
Окрім канонічного NHEJ, існують альтернативні механізми з’єднання кінців, які можуть використовувати короткі гомологічні послідовності.
Такі механізми часто мають більшу мутагенність і можуть спричиняти делеції або хромосомні перебудови.
Їх значення особливо зростає, коли основний шлях NHEJ або HR порушений.
Гомологічна рекомбінація
Гомологічна рекомбінація, HR, використовує гомологічну послідовність ДНК як шаблон для відновлення.
Найкращим шаблоном у клітині, що ділиться, часто є сестринська хроматида, оскільки вона містить практично ідентичну генетичну інформацію.
Тому HR зазвичай забезпечує значно точніше відновлення, ніж механізми, які просто з’єднують кінці розриву. Вона також має ключове значення для відновлення пошкоджених або зруйнованих реплікативних вилок. (Nature)
BRCA1 і BRCA2
BRCA1 і BRCA2 є важливими компонентами системи гомологічної рекомбінації.
BRCA1 бере участь у виборі шляху репарації, обробці кінців дволанцюгових розривів і координації відповіді на пошкодження.
BRCA2 сприяє завантаженню білка RAD51 на одноланцюгову ДНК і формуванню нуклеопротеїнового філамента, необхідного для пошуку гомологічної послідовності та обміну ланцюгами.
Патогенні варіанти BRCA1 або BRCA2 можуть суттєво порушувати HR і підвищувати ризик певних злоякісних пухлин.
RAD51
RAD51 є центральним білком гомологічної рекомбінації.
Після утворення одноланцюгової ДНК RAD51 формує на ній нуклеопротеїновий філамент.
Цей філамент бере участь у пошуку гомологічної послідовності та інвазії ланцюга в непошкоджену ДНК.
Резекція кінців ДНК
Для запуску гомологічної рекомбінації кінці дволанцюгового розриву часто піддаються резекції.
Екзонуклеазні та нуклеазні комплекси видаляють частину одного з ланцюгів, утворюючи 3′-кінцеві одноланцюгові ділянки.
Саме на цих ділянках формується комплекс RAD51, необхідний для пошуку гомологічного шаблону.
Репарація міжланцюгових зшивок
Міжланцюгова зшивка, ICL, — це ковалентне з’єднання двох ланцюгів ДНК.
Таке пошкодження особливо небезпечне, оскільки фізично блокує розділення ланцюгів.
ICL може зупинити і реплікацію, і транскрипцію.
Їхнє усунення потребує взаємодії NER, TLS, HR та спеціалізованих факторів. У людини центральну роль у цьому процесі відіграє шлях Fanconi anemia, або FA.
Система Fanconi anemia
FA-система складається з багатьох білків, які координують розпізнавання та обробку міжланцюгових зшивок.
Одним із ключових етапів є активація комплексу FANCD2–FANCI.
Після цього пошкодження обробляється таким чином, щоб дозволити реплікації продовжитися та створити умови для подальшої гомологічної репарації.
Мутації в генах системи FA спричиняють спадкові синдроми з підвищеною хромосомною нестабільністю, недостатністю кісткового мозку та підвищеним ризиком раку.
Репарація одноланцюгових розривів
Одноланцюгові розриви, SSB, менш небезпечні за DSB, оскільки другий ланцюг залишається неушкодженим і може слугувати шаблоном.
До їхнього відновлення залучаються PARP1, XRCC1, ДНК-полімерази, ДНК-лігази та інші білки.
Одноланцюговий розрив, який не був відновлений і потрапив у реплікативну вилку, може перетворитися на дволанцюговий розрив.
PARP
PARP1 і PARP2 розпізнають певні типи пошкоджень ДНК та приєднують до себе й інших білків полімери ADP-рибози.
Цей процес називається PARylation і сприяє залученню компонентів репарації.
PARP відіграють особливо важливу роль у відповіді на одноланцюгові пошкодження та координації ремонтних процесів.
Інгібітори PARP
Інгібітори PARP стали важливим класом протипухлинних препаратів.
Особливий ефект вони можуть мати в пухлинних клітинах із дефектною гомологічною рекомбінацією, наприклад за певних мутацій BRCA1 або BRCA2.
Це є прикладом синтетичної летальності: порушення одного механізму саме по собі може бути переносимим, але одночасне блокування другого життєво важливого механізму призводить до загибелі клітини.
Транслесійний синтез
Іноді клітина не встигає видалити пошкодження до проходження реплікативної вилки.
Звичайна ДНК-полімераза може зупинитися перед пошкодженою основою. Тоді спеціалізована транслесійна полімераза може тимчасово замінити її та синтезувати ДНК через пошкоджену ділянку.
Це дозволяє завершити реплікацію, але такі полімерази часто менш точні.
Транслесійний синтез тому слід відрізняти від справжнього видалення пошкодження: він переважно забезпечує толерантність до ушкодження.
Контроль пошкодження ДНК
Репарація є частиною ширшої системи відповіді на пошкодження ДНК — DNA damage response, DDR.
DDR охоплює:
розпізнавання пошкодження;
передачу сигналу;
залучення ремонтних білків;
зупинку клітинного циклу;
репарацію;
відновлення реплікації;
за необхідності — запуск старіння клітини або апоптозу.
Таким чином, клітина не просто «ремонтує» ДНК, а координує репарацію з усіма процесами життєвого циклу.
ATM і ATR
ATM та ATR є ключовими кіназами відповіді на пошкодження ДНК.
ATM особливо важлива у відповіді на дволанцюгові розриви.
ATR переважно активується за наявності одноланцюгової ДНК, реплікативного стресу та структур, що виникають під час блокування реплікативної вилки.
Ці кінази активують численні білки, які зупиняють клітинний цикл, регулюють репарацію та координують виживання або загибель клітини.
p53
Білок p53 є одним із центральних регуляторів відповіді клітини на серйозне пошкодження ДНК.
Після активації p53 може спричиняти зупинку клітинного циклу, що дає клітині час для репарації.
Якщо пошкодження надто значні або невиправні, p53 може сприяти запуску апоптозу або клітинного старіння.
TP53 є одним із найчастіше мутованих генів у злоякісних пухлинах.
Контрольні точки клітинного циклу
Репарація повинна бути скоординована з клітинним циклом.
Пошкодження ДНК може спричинити тимчасову зупинку переходів G1/S, внутрішньої контрольної точки S-фази або G2/M.
Це запобігає передачі серйозно пошкодженої ДНК дочірнім клітинам.
Репарація під час різних фаз клітинного циклу
Різні шляхи репарації мають різну доступність залежно від фази клітинного циклу.
NHEJ може функціонувати протягом значної частини клітинного циклу і є особливо важливим, коли немає сестринської хроматиди.
HR значно більше залежить від наявності сестринської хроматиди та тому переважає в S- і G2-фазах.
Репарація та хроматин
У еукаріотів ДНК упакована в хроматин, тому ремонтний білок повинен отримати доступ до пошкодженої ділянки.
Після пошкодження змінюється структура хроматину, відбуваються модифікації гістонів і залучаються білки, які тимчасово роблять пошкоджену ділянку доступнішою.
Наприклад, фосфорилювання гістону H2AX з утворенням γ-H2AX є одним із ранніх маркерів відповіді на дволанцюгові розриви.
Репарація та реплікаційна вилка
Реплікація є одним із найуразливіших процесів для пошкодженої ДНК.
Якщо реплікативна вилка зустрічає пошкодження, вона може зупинитися, розпастися або перебудувати свою структуру.
Клітина використовує TLS, реплікаційні обхідні механізми, гомологічну рекомбінацію та інші процеси для відновлення або стабілізації реплікативної вилки.
Нездатність правильно обробити реплікативний стрес може призвести до дволанцюгових розривів та хромосомної нестабільності.
Постреплікативна репарація
Якщо пошкодження не було усунене до реплікації, після проходження реплікативної вилки може залишитися прогалина в новосинтезованому ланцюзі.
Такі прогалини можуть бути усунені рекомбінаційними механізмами або заповнені за допомогою спеціалізованих полімераз.
Це дозволяє клітині завершити реплікацію навіть тоді, коли частина пошкоджень залишається на батьківській ДНК.
Репарація в прокаріотів
Бактерії мають власний набір систем репарації, багато з яких функціонально подібні до еукаріотичних.
У бактерій добре досліджені BER, NER, MMR, пряма репарація, рекомбінаційна репарація та механізми відновлення дволанцюгових розривів.
Особливе значення має система SOS-відповіді, яка активується при значному пошкодженні ДНК та змінює експресію численних генів, зокрема тих, що беруть участь у репарації та толерантності до пошкодження.
Репарація в еукаріотів
Еукаріотична репарація складніша через наявність великих лінійних хромосом, хроматину, багаторівневої регуляції генів і складного клітинного циклу.
У людини репараційні процеси потребують сотень білків, які працюють у взаємопов’язаних мережах.
Багато з цих білків мають одночасно репараційну, сигнальну, структурну або регуляторну функцію.
Репарація в мітохондріях
Мітохондріальна ДНК також піддається пошкодженню та має власні механізми підтримання генетичної стабільності.
У мітохондріях особливо важливі механізми BER, оскільки вони усувають значну частину окиснювальних пошкоджень.
Набір механізмів репарації мітохондріальної ДНК відрізняється від ядерного та залежить від конкретного типу клітини й пошкодження.
Репарація теломер
Теломери мають незвичайну структуру, яка повинна захищати кінці хромосом від систем репарації.
Клітина повинна відрізняти природний кінець хромосоми від патологічного дволанцюгового розриву.
Спеціалізований білковий комплекс shelterin формує захисну структуру теломер.
Порушення цієї системи може призвести до активації DDR на теломерах, хромосомних злиттів і геномної нестабільності.
Репарація та мутації
Репарація зменшує кількість мутацій, але не усуває їх повністю.
Мутація може виникнути, якщо пошкодження не було розпізнано, якщо воно було неправильно відновлене, якщо реплікація пройшла через пошкоджену ділянку або якщо механізм репарації сам допустив помилку.
Таким чином, мутаційний спектр клітини залежить від співвідношення між типами пошкоджень і активністю різних систем репарації.
Репарація та рак
Порушення репарації ДНК є одним із фундаментальних механізмів виникнення геномної нестабільності.
Якщо клітина втрачає здатність ефективно виправляти помилки або контролювати пошкодження, мутації можуть накопичуватися значно швидше.
Приклади включають дефекти MMR при синдромі Лінча, дефекти NER при ксеродермі пігментній, порушення HR при мутаціях BRCA1/BRCA2 та дефекти інших систем геномної стабільності.
У багатьох пухлинах репараційні шляхи не просто пошкоджені — вони можуть бути перебудовані таким чином, що пухлинні клітини стають залежними від альтернативних механізмів виживання. Саме ця залежність створює можливості для таргетної терапії.
Синтетична летальність
Синтетична летальність виникає тоді, коли порушення двох окремих генів або шляхів разом призводить до загибелі клітини, хоча порушення кожного з них окремо може бути сумісним із виживанням.
Найвідомішим клінічним прикладом є використання інгібіторів PARP при деяких пухлинах із дефектною HR, зокрема пов’язаною з BRCA1 або BRCA2.
Цей принцип став одним із найважливіших прикладів використання фундаментальної біології репарації ДНК у персоналізованій онкології.
Репарація та старіння
З віком змінюється ефективність деяких систем підтримання геномної стабільності.
Накопичення пошкоджень, зміни теломер, реплікативний стрес, епігенетичні зміни та порушення функціонування репараційних систем можуть взаємодіяти між собою.
Однак старіння не можна пояснити лише дефектами репарації ДНК. Воно є результатом взаємодії багатьох процесів, включно з метаболічними змінами, порушенням протеостазу, мітохондріальною дисфункцією та змінами міжклітинної сигналізації. Сучасні огляди також розглядають вікове зниження активності репараційних систем як один із факторів підвищення ризику захворювань.
Спадкові захворювання систем репарації
Мутації в генах репарації можуть спричиняти спадкові синдроми.
До найбільш відомих належать:
Ксеродерма пігментна — дефекти NER, що призводять до надзвичайної чутливості до ультрафіолетового випромінювання та високого ризику раку шкіри.
Синдром Лінча — спадковий дефект MMR, пов’язаний із підвищеним ризиком низки злоякісних пухлин.
Атаксія-телеангіектазія — пов’язана з дефектом ATM і порушенням відповіді на дволанцюгові розриви.
Синдроми Fanconi anemia — порушення системи репарації міжланцюгових зшивок.
Спадкові синдроми, пов’язані з BRCA1/BRCA2 — дефекти гомологічної рекомбінації та підвищений ризик певних видів раку.
Ці захворювання демонструють, наскільки критичною є підтримка стабільності геному для нормального функціонування організму.
Репарація і нейродегенеративні захворювання
Нервові клітини особливо чутливі до накопичення пошкоджень ДНК через їхню тривалу тривалість життя та обмежену здатність до поділу.
Порушення окремих систем репарації пов’язують із деякими нейродегенеративними та неврологічними захворюваннями.
Водночас конкретні механізми залежать від захворювання, типу клітин і виду пошкодження.
Репарація і імунна система
Відповідь на пошкодження ДНК взаємодіє з імунною системою.
Серйозне пошкодження може спричиняти утворення фрагментів ДНК у цитоплазмі, які розпізнаються системами вродженого імунітету.
Важливим зв’язком між DDR та імунітетом є шлях cGAS–STING, який може реагувати на цитозольну ДНК і сприяти утворенню противірусної та запальної відповіді.
Таким чином, репарація ДНК бере участь не тільки в підтриманні геному, а й у регуляції клітинної та імунної відповіді.
Репарація і апоптоз
Якщо пошкодження надто значні або клітина не може надійно відновити геном, продовження її поділу може бути небезпечним для організму.
У такому випадку активуються механізми клітинної смерті, передусім апоптоз.
Це своєрідна остання лінія захисту: замість передачі сильно пошкодженого геному дочірнім клітинам організм усуває клітину.
Репарація і клітинне старіння
Не всі клітини з невиправними пошкодженнями гинуть.
Частина може перейти в стан клітинного старіння — тривалої зупинки проліферації.
Таке рішення дозволяє запобігти розмноженню клітин із нестабільним геномом, хоча накопичення старіючих клітин може мати негативні наслідки для тканин.
Репарація та епігенетика
Репарація ДНК взаємодіє з епігенетичним станом геному.
Пошкодження може змінювати локальну структуру хроматину, а процес його відновлення може супроводжуватися перебудовою нуклеосом і модифікацій гістонів.
Водночас епігенетичний стан ділянки може впливати на доступність пошкодження для репараційних білків.
Отже, репарацію не можна розглядати незалежно від організації геному в хроматин.
Репарація і рекомбінація
Репарація та рекомбінація тісно пов’язані.
Гомологічна рекомбінація може використовувати непошкоджену копію ДНК як шаблон для відновлення.
Водночас рекомбінаційні процеси необхідні не тільки для ремонту пошкоджень, а й для нормального мейозу, генетичної різноманітності та правильного розходження гомологічних хромосом.
Репарація та генетична різноманітність
Репарація загалом зменшує частоту випадкових мутацій, але не усуває генетичні зміни повністю.
У деяких біологічних процесах мутаційні механізми навіть навмисно використовуються організмом. Наприклад, під час формування різноманітності антитіл і рецепторів лімфоцитів спеціальні механізми створюють контрольовані пошкодження ДНК, після чого вони обробляються системами репарації.
Таким чином, репарація може не тільки запобігати мутаціям, а й бути частиною запрограмованої перебудови геному.
Еволюція систем репарації
Системи репарації виникли дуже рано в еволюції клітин.
Базові принципи — видалення пошкоджених основ, вирізання фрагментів, виправлення помилок реплікації та рекомбінаційне відновлення — збереглися у багатьох різних організмів.
Водночас конкретні ферменти та регуляторні мережі суттєво відрізняються між бактеріями, археями та еукаріотами.
Основні білки репарації людини
Серед численних білків репарації особливо важливими є:
UNG, SMUG1, TDG, MBD4 — глікозилази, що розпізнають певні пошкоджені основи.
OGG1 — видаляє 8-оксогуанін.
MUTYH — бере участь у виправленні помилок, пов’язаних з окисненим гуаніном.
APE1 — важливий AP-ендонуклеазний компонент BER.
PARP1 і PARP2 — координують відповідь на певні однониткові пошкодження.
XPC, XPA, XPB, XPD, XPF, XPG — ключові компоненти NER.
MSH2, MSH3, MSH6, MLH1, PMS2 — основні компоненти MMR.
KU70, KU80, DNA-PKcs, XRCC4, XLF, DNA ligase IV — компоненти NHEJ.
BRCA1, BRCA2, PALB2, RAD51 — важливі компоненти HR.
ATM, ATR, CHK1, CHK2, TP53 — ключові регулятори відповіді на пошкодження ДНК.
Це лише частина величезної мережі білків, що підтримують геномну стабільність.
Стадії загальної відповіді на пошкодження ДНК
Незалежно від конкретного шляху, багато реакцій репарації можна умовно описати як послідовність:
Розпізнавання — клітина виявляє аномальну структуру.
Сигналізація — інформація про пошкодження передається іншим білкам.
Зупинка або сповільнення клітинного циклу — створюється час для ремонту.
Обробка пошкодження — пошкоджена ділянка готується до видалення або відновлення.
Відновлення — синтезується правильна ДНК або з’єднуються кінці.
Перевірка — оцінюється результат ремонту.
Відновлення клітинного циклу, старіння або загибель — залежно від результату.
Ця схема є узагальненням: конкретні шляхи можуть значно відрізнятися.
Чим репарація відрізняється від proofreading
Proofreading відбувається безпосередньо під час синтезу нової ДНК.
ДНК-полімераза перевіряє останній доданий нуклеотид і, якщо він неправильний, видаляє його.
Репарація MMR діє пізніше — на помилки, які вже уникнули proofreading.
Отже, proofreading і MMR є послідовними рівнями контролю точності реплікації.
Чим репарація відрізняється від толерантності до пошкоджень
Репарація в строгому значенні усуває пошкодження або відновлює правильну структуру ДНК.
Толерантність до пошкодження дозволяє клітині продовжити функціонування попри те, що пошкодження ще залишається.
Транслесійний синтез є типовим прикладом толерантності.
Це важливе розмежування, оскільки обходження пошкодження не означає його фізичного усунення.
Чи відновлює репарація ДНК молекулу абсолютно без помилок
Не завжди.
Деякі механізми, особливо гомологічна рекомбінація, можуть забезпечувати дуже точне відновлення.
Інші, наприклад певні форми з’єднання кінців або транслесійний синтез, можуть створювати вставки, делеції чи заміни.
Тому результат залежить від типу пошкодження, клітинного циклу, доступності шаблону та конкретного шляху, який був активований.
Репарація як багаторівнева система
Репарацію ДНК не слід розглядати як один процес або один набір ферментів.
Це інтегрована система, що включає:
молекулярне розпізнавання;
ферментативне видалення пошкоджень;
синтез ДНК;
лігування;
контроль реплікації;
ремоделювання хроматину;
сигналізацію через ATM і ATR;
контроль клітинного циклу;
апоптоз;
клітинне старіння;
імунну відповідь.
Сучасне розуміння DDR розглядає всі ці процеси як взаємопов’язану мережу, а не як набір повністю незалежних шляхів.
Медичне значення
Розуміння репарації ДНК має велике значення для діагностики, профілактики та лікування захворювань.
Генетичне тестування генів репарації може використовуватися для визначення спадкового ризику деяких видів раку.
Аналіз дефектів MMR і мікросателітної нестабільності допомагає класифікувати пухлини.
Виявлення дефектів BRCA1/BRCA2 та інших компонентів HR може впливати на вибір терапії.
Інгібітори PARP, препарати, що впливають на ATR, ATM, DNA-PK та інші компоненти DDR, активно досліджуються або використовуються як терапевтичні підходи. Сучасні дослідження також розглядають можливість фармакологічного посилення окремих репараційних шляхів.
Репарація ДНК у сучасній онкології
Пухлинні клітини часто мають підвищене пошкодження ДНК через швидку проліферацію, метаболічний стрес і дію онкогенних факторів.
Одночасно вони можуть втрачати один або декілька репараційних шляхів.
Це створює парадокс: пухлинні клітини генетично нестабільні, але водночас залежать від залишкових систем репарації, які дозволяють їм виживати.
Саме тому DDR є одним із найбільш активно досліджуваних напрямів сучасної протипухлинної терапії.
Історія дослідження репарації ДНК
Вивчення репарації ДНК сформувалося як окрема галузь молекулярної біології у XX столітті.
Дослідження бактерій, дріжджів і клітин людини дозволили встановити існування генетично контрольованих систем, які визначають чутливість до ультрафіолету, мутагенів та інших пошкоджувальних факторів.
Особливо важливий внесок у розуміння BER, NER та MMR зробили Томас Ліндал, Азіз Санджар і Пол Модріч. За відкриття механістичних принципів репарації ДНК вони отримали Нобелівську премію з хімії 2015 року.
Сучасні напрями досліджень
Сучасні дослідження репарації ДНК зосереджені на детальному картуванні пошкоджень по всьому геному, структурній біології ремонтних комплексів, ролі хроматину, взаємодії DDR з імунною системою та розробленні таргетних препаратів.
Особливий інтерес становлять пухлини з дефектами певних шляхів репарації, оскільки вони можуть мати специфічні вразливості.
Також досліджуються способи фармакологічної модифікації активності репараційних систем, зокрема пошук молекул, здатних посилювати окремі шляхи відновлення ДНК. (Royal Society of Chemistry)
Загальна схема вибору шляху репарації
У спрощеному вигляді тип пошкодження визначає переважний механізм:
Невелика модифікація окремої основи → BER.
Велика деформація подвійної спіралі → NER.
Помилка спарювання після реплікації → MMR.
Окреме специфічне хімічне ушкодження, яке можна повернути назад → пряма репарація.
Одноланцюговий розрив → спеціалізована SSB-репарація, часто за участю BER/PARP-залежних механізмів.
Дволанцюговий розрив → NHEJ або HR.
Міжланцюгова зшивка → комплексна ICL-репарація із залученням FA, NER, TLS та HR.
Пошкодження, яке блокує реплікацію → репарація або толерантність до пошкодження, включно з TLS.
Ця схема спрощена, оскільки реальні клітинні реакції часто залучають одночасно декілька шляхів. (DOI)
Значення репарації для життя
Репарація ДНК є одним із фундаментальних механізмів існування клітини. Вона підтримує стабільність геному, забезпечує точність передачі спадкової інформації, запобігає накопиченню небезпечних мутацій і дозволяє клітині переживати неминучі пошкодження.
Її ефективність залежить від складної взаємодії десятків і сотень білків, ферментів, контрольних точок та структурних компонентів хроматину.
Головний принцип репарації полягає в тому, що клітина не просто намагається «полагодити» ДНК. Вона спочатку визначає характер пошкодження, оцінює його небезпеку, вибирає відповідний шлях, тимчасово змінює клітинний цикл, відновлює структуру геному, перевіряє результат і, якщо відновлення неможливе, може зупинити поділ або знищити пошкоджену клітину.
Саме ця багаторівнева система дозволяє ДНК залишатися достатньо стабільним носієм генетичної інформації, незважаючи на постійний потік хімічних і фізичних пошкоджень. (Наццентр біотехнологічної інформації)